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透射熒光顯微鏡與反射熒光顯微鏡的區(qū)別及優(yōu)缺點

        1、透射熒光顯微鏡：激發(fā)光源通過聚光鏡穿過試樣材料激發(fā)熒光。常用暗場聚光器，也可使用普通聚光器，調(diào)節(jié)反射鏡使激發(fā)光向試樣轉(zhuǎn)移和側(cè)射。這是一種相對老式的熒光顯微鏡。優(yōu)點是在低倍率下熒光強，但缺點是隨著倍率的增加熒光減弱。因此，最好觀察較大的試樣材料。
         2、落射熒光顯微鏡：這是現(xiàn)代發(fā)展起來的一種新型熒光顯微鏡。不同之處在于激發(fā)光從物鏡下落到試樣表面，即照明聚光器和收集熒光的物鏡使用同一個物鏡。需要在與光學(xué)鈾成 45 度角的光路中添加二色分束器。激發(fā)光被反射到物鏡中并集中在樣品上。樣品產(chǎn)生的熒光被物鏡表面和蓋玻片表面反射。同時，激發(fā)光進入物鏡，返回二向色分光鏡，使激發(fā)光和熒光分離，剩余激發(fā)光被阻擋濾光片吸收。例如，可以使用不同的激發(fā)濾光片/雙色分光鏡/阻擋濾光片的組合來滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。這種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野均勻，成像清晰，放大倍數(shù)越大，熒光越強。
        透射熒光顯微鏡的優(yōu)缺點
        光源：高壓汞燈或鹵素燈。
        聚光鏡：使用暗場聚光鏡來分離激發(fā)光和熒光。
        目標：可以使用任何類型的目標。
        標本：因為是透射觀察，薄標本比較適合。
        優(yōu)點：①由于使用了暗場聚光鏡，激發(fā)光不能進入物鏡，因此容易形成暗背景并獲得良好的對比度，任何物鏡都可以進行觀察。 ② 使用低倍物鏡時，比反射熒光顯微鏡更亮。
        缺點：聚光鏡的中心和高度必須調(diào)整正確，否則無法獲得明亮的熒光圖像。由于暗場聚光鏡的焦距限制，不能使用厚載玻片。視場的照明面積不宜過大，否則熒光標本的熒光顏色很容易褪色。不適用于厚的或不透明的樣品。
        反射熒光顯微鏡的優(yōu)缺點
        光源：高壓汞燈或鹵素燈。
        聚光鏡：由于物鏡充當聚光鏡，因此不需要聚光鏡。
        事物鏡子：使用的物鏡必須透過足夠的紫外光，本身不產(chǎn)生熒光，對數(shù)值孔徑?jīng)]有限制。
        標本：可以觀察到厚標本或不透明標本。
        優(yōu)點：①由于物鏡兼作聚光鏡，無需進行多次調(diào)整。 ②孔徑光闌和視場光闌的效果可以通過使用Korra照明法來發(fā)揮。 ③物鏡的數(shù)值孔徑不受限制，在高倍率下也可以獲得高分辨率的圖像。 ④也可以觀察厚或不透明的標本，也可以使用厚蓋玻片。 ⑤其他觀察方法也可與反射熒光結(jié)合使用，特別是與相差法和透射微分干涉差法結(jié)合使用。 ⑥可避免不必要的熒光褪色現(xiàn)象。
        缺點：使用地倍率物鏡時，成像比較暗，必須使用數(shù)值孔徑大的物鏡。濾光片系統(tǒng)必須有效地分離激發(fā)光和熒光。